Bioquímica Clínica, Fase premetrológica

TEMA 4: FASE PREMETROLÓGICA. VARIABILIDAD ANALÍTICA. EVALUACIÓN INICIAL Y MANTENIMIENTO DE LA CALIDAD ANALÍTICA. TECNICAS HABITUALES EN BIOQUÍMICA CLÍNICA.

A continuación de la premetrología.

·         Informatización

·         Medida

·         Control de calidad

Incluye todos los pasos relacionados con el proceso de medida.

VARIABILIDAD ANALÍTICA

Todas las determinaciones están influenciadas por una serie de factores que la pueden apartar de su valor verdadero.

Causas:

·         Errores aleatorios: aumentan la variabilidad.

·         Errores sistemáticos: desplazan la medida con un sesgo positivo o negativo. No afectan mucho a la variabilidad. Podemos encontrar errores:

ü  Constantes: siempre del mismo valor

ü  Proporcionales: un porcentaje del valor de la medida.

Para llevar a cabo el control del análisis se emplean muestras control: especímen o solución que se analiza únicamente para el control de calidad, y no para la calibración (IFCC)

Calibración: es una función que conecta de forma matemática la lectura analítica con el valor nominal de la sustancia que se mide. Para llevar a cabo la calibración son necesarios unos patrones (estándar de calibración o calibradores), que son especímenes que contienen una cantidad conocida del componente que se analiza. Tipos (IFCC):

·         Primario: aquellos en los que la concentración se determina disolviendo una cantidad (determinada por pesada) en un disolvente adecuado.

·         Secundario: aquellos en los que la concentración se determina utilizando un método analítico de fiabilidad reconocida.

EVALUACION INICIAL DEL MÉTODO

Las prestaciones de un método que se deben evaluar son:

·         Precisión (imprecisión)

·         Exactitud (inexactitud): sesgo

·         Sensibilidad y límite de detección

·         Linealidad y rango analítico

·         Especificidad e interferencias

Precisión: concordancia entre los valores obtenidos en un conjunto de medidas obtenidas en una misma muestra

Imprecisión: discordancia de los valores obtenidos. Se define como la desviación estándar (ds) o el coeficiente de desviación (CV) de los resultados de un conjunto de medidas repetidas (dispersión). Da información del error aleatorio. El cálculo se realiza a través de la medida de 15 o 20 series, donde se valora la sustancia en duplicado y triplicado. Fuentes:

·         Utilización de diferentes reactivos

·         Distintos operadores

·         Diferentes estándares de calibración.

Exactitud: concordancia entre el valor medido y el valor teórico.

Inexactitud: diferencia entre el valor obtenido y el valor teórico. Se define como la diferencia numérica entre el valor medio de una serie de determinaciones y su valor verdadero.

Sensibilidad: capacidad del método para discriminar entre resultados muy parecidos. La sensibilidad se puede estimar a partir de la pendiente de la recta de calibrado (a mayor pendiente, mayor es la sensibilidad).

Límite de detección: resultado más pequeño que puede diferenciar de un blanco adecuado, con una probabilidad del 95%

Intervalo o rango analítico: intervalo de la concentración o de la magnitud que se mide.

Linealidad: determina el rango analítico en el que existe una relación lineal entre el valor real y el obtenido con el método evaluado. Para los ensayos se utilizan calibraciones de uno o dos puntos, se supone la linealidad.

Especificidad: capacidad de un método para medir las sustancias que se desean analizar.

Interferencias: influencias que ejercen determinadas sustancias sobre la exactitud de un método que se está utilizando para medir otra sustancia. Por ejemplo, pueden generar interferencias la ictericia, la lipemia o la hemolisis.

Determinación de interferencias: comparar los valores obtenidos con lo que proceden del método de referencia. Ir añadiendo cantidades crecientes de la sustancia que produce la interferencia.

ENZIMOLOGÍA CLÍNICA

·         Enzimas como reactivos, para medir otras sustancias.

·         Enzimas como marcadores, de la presencia de una enfermedad.

ü  Actividad enzimática

ü  Analizar las diferentes isoformas.

ENZIMAS COMO REACTIVOS

Capacidad que tienen distintas enzimas para la transformación de unos productos en otros.

La glucosa, mediante esta técnica, añadiendo un reactivo se va a transformar en un producto coloreado que se puede cuantificar.

Las enzimas formarán parte del reactivo (son una herramienta). Este tipo de reacciones pueden ser varias reacciones acopladas o de un único paso. Lo más normal es que se necesiten varias enzimas.

Se puede cuantificar:

·         Como aparece el producto (más común)

·         Como desaparece el sustrato.

En cuanto al momento en el que se mide el producto:

·         Punto final: cuando se hace la lectura la reacción ha finalizado. Ya no se va a formar más producto. El tiempo no es crítico.

·         Punto múltiple: varias lecturas a lo largo del tiempo. Se ve como varía.

·         Cinética: se registra la formación del producto durante todo el tiempo crítico.

Lo más habitual es que se realicen a punto final.

ENZIMAS COMO MARCADORES

En el organismo las enzimas se encuentran en el interior de la célula y sólo podemos encontrar actividad en suero o plasma de aquellos que se han liberado por daño celular.

Cuando se observa un aumento de enzima en suero o plasma sospechamos de daño tisular.

Se determina la actividad enzimática.

Se hacen por puntos múltiples, porque hay que calcular la velocidad de la enzima (necesarios al menos dos puntos). Hay que hacer una lectura cuando está aumentando, porque luego se hace constante.

La actividad aumenta en sangre, puede ocurrir que la enzima se exprese en más de un tejido (por ejemplo la glucolisis en todos los tejidos).

Alguna de las enzimas que se expresan, tienen diferentes isoformas en diferentes tejidos.

Isoformas: formas de una enzima, que catalicen una misma reacción, que poseen diferencias en su estructura. Las variaciones en la estructura se reflejan en diferentes propiedades fisicoquímicas.

Nosotros tenemos diferentes isoformas:

·         Cambios en la estructura del gen. Codificados por genes distintos que afectan a la forma pero no al sitio activo.

·         Diferentes modificaciones postraduccionales: por ejemplo la glicoxilación, fosforilación, acetilación, lipidación, formación de agregados,…

Algunas isoformas pueden tener diferente localización subcelular.

TECNICAS INMUNOQUÍMICAS

Basadas en las reacciones Antígeno-Anticuerpo. Hay muchos formatos, buscando diferentes características de funcionamiento. Determinación de proteínas (hormonas, marcadores tumorales, anticuerpos y otras proteínas plasmáticas).

Clasificación:

·         Diseño: forma en la que se va a unir:

ü  Competitivos: unión reversible de dos ligandos con su contrapuesto inmunitario. El compuesto que se quiere medir sin marcar, y el otro ligando va marcado. Generalmente el contrapuesto es un anticuerpo porque lo que se quiere medir es una proteína. Hormona proteica, por ejemplo la insulina: añadiríamos insulina marcada. Ambas van a competir por unirse a su contrapuesto (anticuerpo anti-insulina). A mayor concentración de insulina la lectura será menor, porque menos insulina marcada se va a unir, y al lavar se va, por lo que va a aparecer menos señal. Pueden ser:

§  Simultáneos: se añade todo a la vez.

§  Secuenciales: se añade primero uno y luego otro.

ü  No competitivos o tipo sándwich: utilizan dos anticuerpos, uno de ellos marcado. Esto tiene desventajas, puesto que los anticuerpos van a reconocer un epítopo. La molécula tiene que tener suficiente tamaño para poder expresar dos epítopos diferentes. Hay moléculas que son muy pequeñas, por ejemplo las hormonas tiroideas (T₃ y T₄), que no expresan dos epítopos. Este proceso requiere generar dos tipos de anticuerpos, lo que eleva el gasto, y cuanto más compleja es la proteína, más difícil es de obtener el anticuerpo.

·         En función del efecto que tiene la unión:

ü  Heterogéneos: el compuesto que está marcado se comporta igual en forma libre o tras la unión a su contrapuesto inmunitario. Va a requerir siempre un proceso de separación (lavado, microfltración,…) esto genera un menor coste, peor no se puede automatizar.

ü  Homogéneos: el compuesto marcado se comporta diferente de forma libre que tras la unión a su contrapuesto inmunitario. No requiere separación. Es más preciso, puesto que se evita una fuente de error (al omitir los lavados). Se puede automatizar con lectores especiales.

TIPO DE MARCAJE

·         Enzima:

ü  Color

ü  Fluorescencia

ü  Luminiscencia (luz)

·         Isótopos

ü  I¹²⁵: ionización gamma. Irradia más y contamina menos. Atraviesa la materia. Vida media corta

ü  H³: ionización beta. Irradia menos, pero se fija a las moléculas orgánicas. Vida media más larga.

ü  C¹⁴: ionización beta.

·         Cromógeno

·         Fluoróforo

·         Luminiscente

Ensayos:

·         Enzimático

ü  ELISA: ensayo inmunométrico sobre un soporte sólido. Son heterogéneos. Pueden ser competitivos o no competitivos. Los más habituales son los que generan color.

·         Isótopos

ü  RIA: ensayo radio inmunométrico: es siempre competitvo. No se utiliza ningún tipo de soporte. En el paso de separación previo a los lavados hay un paso de precipitación. Es muy sensible.

ü  IRMA: es no competitivo, heterogéneo. También precipita.

·         Otros:

ü  Turbidimetría: turbidez

ü  Nefelometría: mide la luz que se ha dispersado.